本產品用於定性分析人體活檢切片組織中C4d在腎小管周毛細血管的沉積

Anti C4d(BI-RC4D)
規格 ： 250μl/每瓶
形式： 液體IgG 片段 ，蛋白G 層析法純化
應用 ： 人組織石蠟和冰凍 切片

Anti C4d, FITC 

規格 ：100μl/每瓶
形式: 液體IgG 片段 ，蛋白G 層析法純化
應用 ： 流式細胞術
 
產品優勢
C4d多克隆抗體
可同時作用於石蠟切片和冰凍切片上

臨床檢測意義
 
C4d 在腎小管周毛細血管的沉積可作為診斷抗體介導排斥反應的重要依據 ，是抗體介導的移植腎損傷的標誌 ，與移植腎的預後相關 ，是腎失功獨立預測因素 。

受者人體循環中同種抗體和移植的內皮細胞結合是首要目標 。活的內皮細胞可以通過帽化 ，脫落與 內化快速消除來自細胞表層的結合抗體 。

C4d 是補體因子C4激活後的裂解片段 ，是經典補體級聯反應的成分 ，通過抗體與特異性的目標分子 結合而啟動 。C4d檢測被看做是抗體排斥同種移植反應的間接印證或者印記 。在大多的文獻中都將 C4d看做是腎髒 ，心髒 ， 肝髒以及其他移植中的重要的指標 。

移植腎中急性抗體介導排斥的鑒定
1. 腎小球 C4d 沉積可先於局灶節段性腎小球硬化的發展 van de Lest et al., Kidney Int, 2019; 96(3):738-749.
2. “腎小球 C4d 沉積可先於 FSGS 的發展 ，這表明補體激活可能在 FSGS 的發展中發揮致病作用 。” C4d 在腎移植受者活檢組織中的重要性 。 Corrêa, Clin Develop Immun, 2013; 2013:678180.
3. “對活檢標本中 C4d 染色呈陽性的 AMR 進行進一步研究 ，以及對可能參 與這一過程發病機製的新型常規標誌物的研究都非常重要 。” 患有急性 T 細胞介導的排斥反應的腎移植受者對治療的反應和長期結果 Bouatou et al., Am J Transplant, 2019; 19(7):1972-1988. “因此 ，對急性 TCMR 治療反應的臨床 、組織學和免疫學評估揭示了對治療 反應的不同特征 ，具有不同的結果 。”


采樣及送檢方式
醫生從患者體內切取 ，鉗取或穿刺取出病變組織 ，製作成石蠟或冰凍切片


工作步驟
抗C4d 抗體 ，石蠟切片（4.5%中性緩衝液福爾馬林固定） ，免疫組化法
1 .切片脫蠟及水化
2 .抗原修複 ，在125℃TRIS/EDTA修複液(PH8.5) 中高壓5min,冷卻20min至室溫 。 TRIS/EDTA緩衝液 ：10ml 1M TRIS(ph9)+20ml 0.05M EDTA(ph7.5)+970ml H₂Obidest
3.PBS 衝洗
4 .PBS 配製3% H₂O₂ 對內源性過氧化物酶進行封閉 10min
5. PBS 衝洗
6 .滴加UltraVsion Block 孵育5min
7 .PBS 衝洗
8. 滴加抗C4d抗體 ，用PBS-BSA(1%BSA)1 ：30-1 ：50稀釋 ，室溫下孵育60min
9. PBS 衝洗
10. 滴加Primary Antibody Enhancer ， 在室溫下孵育20min
11. PBS 衝洗
12.滴加HRP Polymer(酶標二抗) ，在室溫下孵育30min
13. PBS 衝洗
14. DAB 或AEC 顯色劑顯色（根據染色深淺調整時間）
15. 水龍頭水衝洗10min
16. Mayer 蘇木精複染 1min
17. 水溶性封片劑封片
 
抗C4d抗體 ， 冰凍切片 ， 間接免疫熒光法
1. 冰凍切片在用PBS 1:20-1:30 稀釋兔抗C4d多克隆抗體液中室溫下孵育 30min ，
2.PBS 衝洗4次
3. 用FITC 標記二抗兔抗C4d抗體（根據供應商提供比例稀釋） ，之後孵育檢測結合的抗體
4. PBS 衝洗4次
5. 水溶性封片劑封片
 
Frequently asked questions 常見問題

1. 對於C4d多克隆抗體 ，應當使用什麽作為陽性控製 ？

最好的陽性控製是有抗體介導排斥反應的病例 。證明抗體介導排斥反應最理想的就是來自同一樣品的冰凍切片上的陽性C4染色 。或者是有抗體介導排斥反應典型臨床表現且被Luminex技術證明或傳統交叉配型測試過的供者特異性抗體病例也可以
如果沒有明確的體液排斥反應可以作為陽性控製 ，你可以使用膜性腎小球腎炎（自體腎或者TX）切片, C4d將會沿著腎小球基底膜（GBM Fig 1A）產生一個顆粒狀的染色模式 ，幾乎同由IgG(Fig 1B)產生的染色模式一樣. 有必要多測試幾個病例因為補體成分經典途徑產生的沉積物在MGN(膜性腎小球腎炎)中是易變的 。

2. C4d診斷相關的染色模式是什麽 ？
  抗體介導排斥反應唯一的診斷相關的染色模式是沿著管周毛細血管（PTH Fig2A）的線性C4d沉積物.在最近的一項調查中發現在管周毛細血管中不連續的粗糙顆粒狀的典型的病灶染色模式與抗體介導排斥反應沒有關聯性 。

3. C4d 沉積物在其他位置有什麽意義 ？
  C4d沉積物在腎髒的不同腔室都可以發現 。總的來說非管周毛細血管對抗體介導排斥反應沒有診斷的相關性（除了腎小球內皮細胞染色 Fig 3A）. 在動脈和小動脈壁上（Fig 2C, 箭頭跟三角形）很常見的可看到多變數量的C4d 。例如在免疫複合物介導的腎小球腎炎匹配的其他補體（Fig 2D ，箭頭和三角形）的分配與模式這樣許多的例子中可以找到腎小球C4d沉積物 。此外在慢性移植腎小球病中也會發現腎小球C4d 沉積物 。腎小球病中的C4d染色很明顯的會影響大部分甚至整個毛細血管壁（對比在一些抗體介導排斥反應病例中發現的官腔型內皮細胞染色模式） 。腎小球病中的腎小球毛細血管壁染色模式經常會聯想到在有內皮沉積物的免疫複合物介導的腎小球腎炎中觀察到的染色模式 。在很多病例中 ，其他補體成分的免疫組化和免疫球蛋白需要作出可靠的有差別的診斷 。
 
4. C4d 多克隆抗體是否適用在免疫熒光法的冰凍切片上 ？
  是 ，C4d 多克隆抗體可以用在冰凍切片上 ，且染色結果等同於單克隆抗C4d抗體中觀察到的模式 ，但單克隆抗C4d抗體不適用與石蠟切片 。

5. 理想的染色步驟是什麽 ？

每個實驗室本身可以判斷何為理想的染色步驟 。合理的是要從供應商提供的C4d抗體開始染色步驟 。熱誘導抗原修複在大多實驗室中都是必須的 。一些公司會發現高壓修複要優於微波修複 。因為後者會造成敏感性降低 。但是這和其他染色細節仍然需要測試和根據實驗室情況去調節 。

6. 石蠟切片免疫組化的敏感度等同於冰凍切片免疫發光的敏感度嗎 ？
通過一些專門解決這個問題的研究得出結論 ：冰凍切片免疫熒光法總的來說比石蠟切片免疫組化的敏感度高 。考慮這個情況 ，Banff 分類
 

7. 如果不能對切片采取高壓處理 ，是否有其他的方法處理切片 ？
其他的方法就是用微波修複抗原 ，由於尊龍凱時對此種方法沒有驗證過，客戶可以嚐試不同抗體稀釋方法來驗證非特異性結合 。

8. 工作步驟上麵的參考信息是否使用抗體
所引用的參考信息的確使用了那種抗體 。請看Link Literature Reference 或谘詢客服專員索取信息 。

9. IgG的濃度是什麽 ？
0.2mg/ml,純IgG,通過蛋白質G純化 ， 無載體蛋白

10. 工作步驟中所給出的PBS 緩衝液僅僅就隻是純PBS緩衝液嗎 ？是否包含BSA 或者一些蛋白質在裏麵 ？
緩衝液隻是純的PBS 溶液 10mM/PBS/140Mm NaCI ph7

11. 抗體是否會和狗發生交叉反應 ？
總的來說C4d的活性在哺乳類的物種中比較保守 。所以有很大的可能性在狗身上也會發現C4d.目前對於跟狗的交叉性反應還不清楚 。

12. H₂O₂ 封閉液是使用Superstain 還是其他的 ？
30% Fluka Hydrogen peroxide ,1:10 甲醛稀釋 ，室溫下10min(最終濃度3%)

13. 工作步驟上指出要用20mM的PBS—配方是什麽 ？
20mMPBS 溶液要準備200mM的原液
A: 5.244g NaH2PO4x1H2O+大概190ml aqua bidest, PH=7.4
B:28.83g Na2HPO4x2H2O+大概810ml aqua bidest, PH=7.4
混合A和B,PH控製7.4 ， 添加到1L工作液中 ， 在0.9% NaCi中稀釋原液1:10

14. 用Harris 蘇木精複染會出現問題嗎 ？
用Harris 蘇木精複染不會有問題 。反應產品穩定 ， 你需要相應的優化複染時間（使用你常用的石蠟切片）

15. 有沒有可能每次衝洗5min?
是 ，最少要5min的衝洗時間 。 你應當更換PBS溶液4次 。


參考文獻
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本品僅用於科研 。